人結(jié)直腸癌細胞熒光素酶標記 LOVO+LUC

細胞代號：LOVO+LUC

細胞培養(yǎng)條件：F12K+10%FBS+1%P/S   

細胞生長形態(tài)：貼壁生長

培養(yǎng)基中氣泡對細胞貼壁的影響

在培養(yǎng)細胞時，普通手動移液器加細胞液過程可能會由于操作速度過快造成氣泡產(chǎn)生，氣泡會破壞細胞附著，導致細胞培育的效果不佳，產(chǎn)生誤差，所以在移液時需要進行練習，以避免氣泡生成，同時注意消除吸頭內(nèi)的空氣，最好是使用外置活塞式分液器，因為外置活塞式分液器可以在不產(chǎn)生氣泡的情況下轉(zhuǎn)移易氣泡液體。

正在培養(yǎng)中的細胞應每隔一定時間觀察一次，觀察的內(nèi)容包括細胞是否生長良好，形態(tài)是否正常，有無污染，細胞進入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細胞盡早進入生長狀態(tài)。

超凈工作臺內(nèi)的無菌工作規(guī)范

細胞培養(yǎng)是一項十分嚴謹且專業(yè)的實驗過程，超凈工作臺原理是在特定的空間內(nèi)，室內(nèi)空氣經(jīng)預過濾器初濾，由小型離心風機壓入靜壓箱，再經(jīng)空氣高效過濾器二級過濾，從空氣高效過濾器出風面吹出的潔凈氣流具有一定的、均勻的斷面風速，可以排除工作區(qū)原來的空氣，將塵埃顆粒和生物顆粒帶走，以形成無菌的高潔凈的工作環(huán)境。所以實驗一般在超凈無菌工作臺上進行，所以超凈工作臺一定要保持整潔衛(wèi)生規(guī)范。超凈工作臺上應該采用從左到右，從潔凈的實驗空間到放置實驗廢品的臟污空間擺放。

如果在實驗過程中隨意擺放過多實驗器材，容易阻擋超凈工作臺的氣道流通，形成湍流，容易使污染物進入容器，讓細胞受到污染。

正確管理CO?培養(yǎng)箱

CO?培養(yǎng)箱是存儲細胞和培養(yǎng)細胞生長的實驗器材，實驗人員在實驗過程中難以避免需要擺放細胞培養(yǎng)皿進CO?培養(yǎng)箱，這個時候就需要注意，實驗人員應該避免頻繁的開關CO?培養(yǎng)箱，讓箱內(nèi)的實驗環(huán)境受到影響無法及時恢復，導致細胞培養(yǎng)生長受到干擾。同時，在CO?培養(yǎng)箱內(nèi)擺放的樣品需要注意規(guī)范好擺放的位置并做好正確的標記，做到培養(yǎng)箱門快開快關，一般的實驗室培養(yǎng)箱往往多人合用，建議合用的培養(yǎng)箱配置內(nèi)外門，大化程度減少開關門對培養(yǎng)箱環(huán)境的影響，避免實驗樣品混淆和交叉污染的風險。

CO?培養(yǎng)箱的常規(guī)維護和消毒

CO?培養(yǎng)箱需要保持濕潤的環(huán)境，所以需要定期（1-2周）將盛液盤整體移出，將殘留的水清空，用70%的酒精或異丙醇溶液擦拭消毒，待干燥后添加無菌蒸餾水，再放回培養(yǎng)箱內(nèi)。

CO?培養(yǎng)箱一般需要1個月進行一次消毒清理，實驗人員需要按規(guī)范拆除培養(yǎng)箱的擱板、擱架及水盤，將酒精噴灑于布上，再進行腔體的清潔，培養(yǎng)箱內(nèi)盡量避免死角的存在，擦拭腔體內(nèi)每個位置，再將移除的配件擦拭清潔后，安裝到位。

目前自動化設備已代替人工復雜操作，可通過運行高溫消毒程序，有效避免污染發(fā)生。

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細胞復蘇

細胞復蘇和凍存講究“慢凍快溶"，復蘇時一定要將凍存在液氮或-80℃中凝固的細胞凍存液快速融化至37℃，使胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結(jié)晶，對細胞造成損害。

復蘇準備

?打開水浴鍋加熱至37℃。

? 超凈臺上放好離心管（一般15ml的），細胞培養(yǎng)瓶，移液管，紫外滅菌至少20至30分鐘，吹風5至10分鐘除去臭氧。

?37℃預熱好要復蘇細胞的培養(yǎng)液，也可以不用預熱培養(yǎng)液，根據(jù)細胞情況選擇。

?向離心管中加約5至10ml培養(yǎng)液，從液氮罐或-80℃中取出凍存細胞，立即將凍存管放入37℃水浴中并輕輕搖動，待融化后（約2min即可）立即將解凍的細胞轉(zhuǎn)移至含培養(yǎng)液的離心管中，800-1000rpm下離心5min，棄上清，加適量*培養(yǎng)液輕輕吹打重懸細胞后轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶中，輕晃使瓶底液體分散均勻，標好細胞名稱、代數(shù)、復蘇日期，顯微鏡下觀察后放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中。一般貼壁細胞過夜即可貼壁，換液和傳代時間根據(jù)不同細胞生長情況而定。

細胞復蘇注意事項

?復蘇時動作要快，盡量減少胞內(nèi)形成冰晶，影響復蘇后細胞活率。

? 融化時盡量不要碰到管口，以免容易造成污染。

?若一次性需要復蘇細胞很多，可以分批水浴解凍，防止傳熱不佳使得細胞融化時間延長。

?若需要同時復蘇好幾種細胞，提前在離心管和培養(yǎng)瓶上做好標記，或記住自己擺放的位置，不要弄混亂。

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