MIA PaCa-2 胰腺癌細(xì)胞系

背景：

     胰腺癌是第四大致死性腫瘤，預(yù)計(jì)2030年將位居第二?；谑欠窨汕谐?，非轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者分為三類：1）可切除2）可能切除3）局部進(jìn)展。根據(jù)目前NCCN和ASCO的指南推薦，患者處于可切除狀態(tài)且無(wú)顯著升高的CA-19-9、大的原位腫瘤、局部大淋巴結(jié)或極其疼痛，應(yīng)在吉西他濱+卡培他濱或FOLFIRIN OX（5-FU、亞葉酸、奧沙利鉑和伊立替康）治療后直接手術(shù)。輔助治療的作用仍不清楚，但邊緣陽(yáng)性切除尤應(yīng)考慮采用輔助治療。FOLFIRINOX是目前可能切除或局部進(jìn)展的優(yōu)選新輔助治療方案。臨床研究持續(xù)關(guān)注可切除腫瘤患者是否應(yīng)接受術(shù)前。我們比較了改良FOLFIRINOX（mFOLFIRINOX）新輔助治療與吉西他濱輔助治療（adj-gem）對(duì)行切除的胰腺癌患者的臨床轉(zhuǎn)歸與病理標(biāo)志。

方法：

本研究回顧性入組了2006年至2017年俄亥俄州立大學(xué)患者。雖然認(rèn)為接受吉西他濱輔助治療的患者可以通過(guò)切除，但機(jī)構(gòu)腫瘤委員會(huì)小組規(guī)定，接受neo-mFOLFIRINOX治療的患者分為可切除性（BR）或不可切除性（UR）胰腺癌患者。111例患者接受了adj-gem（平均周期為5.5），52例患者接受了neo-mFOLFIRINOX治療（平均周期為3.5）。采用Kaplan-Meier模型法計(jì)算各自生存率，并用Cox回歸及l(fā)og-rank檢驗(yàn)進(jìn)行了分析。

結(jié)果：

      中位隨訪時(shí)間為21.3個(gè)月時(shí)，neo-mFOLFIRINOX組和adj-gem 組的中位OS分別為 35.4個(gè)月和21.8個(gè)月（HR 0.56，95% CI，0.37-0.84，p = 0.005）。neo-mFOLFIRINOX組和吉西他濱輔助治療組的3年OS率分別為46%和 22%（p = 0.001）。neo-mFOLFIRINOX組和adj-gem組的中位無(wú)疾病生存期（DFS）分別為18.6個(gè)月和12.0個(gè)月（HR 0.63，95%CI，0.43-0.93，p = 0.022）。neo-mFOLFIRINOX組和adj-gem組的3年DFS率分別為17%和11%（p = 0.02）。在手術(shù)病理標(biāo)本復(fù)查時(shí)，與adj-gem組相比，neo-mFOLFIRINOX組具有較低的腫瘤等級(jí)、神經(jīng)浸潤(rùn)和淋巴管浸潤(rùn)率、病理T分期、病理N分期和較少的陽(yáng)性淋巴結(jié)數(shù)量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p < 0.05）。neo-mFOLFIRINOX組中R0切除率比adj-gem組高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（51.9%與40.4，p = 0.2）。兩組之間的平均年齡和體能狀態(tài)相似。

PC-12(高分化)   大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株

PECA 小鼠皮膚鱗狀細(xì)胞癌

PH 成人急性單核細(xì)胞白血病

PK-15 豬腎細(xì)胞

Raji 人B淋巴瘤細(xì)胞

RAW264.7   小鼠單核細(xì)胞

RSC96 大鼠雪旺細(xì)胞

Saos-2 人成骨肉瘤細(xì)胞

SCL-1 人皮膚鱗癌細(xì)胞

SK-BR-3 人乳腺癌傳代細(xì)胞

SK-OV-3 人卵巢癌細(xì)胞

SMMC-7721 人肝癌細(xì)胞

SNU-899 上呼吸消化道鱗狀細(xì)胞癌

SPEC-2 子宮內(nèi)膜漿液性表面乳頭狀癌細(xì)胞

ST 豬胎睪丸細(xì)胞

SU-DHL-6 彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤生發(fā)中心B細(xì)胞型

SV40 MES 13 小鼠腎小球系膜細(xì)胞

SV-HUC-1 人正常膀胱上皮細(xì)胞

SW480   人結(jié)直腸癌細(xì)胞

SW620 人結(jié)腸腺癌細(xì)胞

SW900 肺鱗狀細(xì)胞癌

T24   人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞

TE-1 人食管癌細(xì)胞

THP-1 人急性單核細(xì)胞白血病單核細(xì)胞株

TM3 小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞

TPC-1 人甲狀腺乳頭狀癌的細(xì)胞系

U118MG 人星形膠質(zhì)細(xì)胞

U266 人骨髓瘤細(xì)胞

U87MG  人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤

WiDr 人大腸癌細(xì)胞

Yac-1 小鼠淋巴瘤細(xì)胞

山羊MSC細(xì)胞 山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

山羊關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞

MIA PaCa-2 胰腺癌細(xì)胞系

原代培養(yǎng)及其操作步驟

原代分離細(xì)胞培養(yǎng)是指從供體內(nèi)取出組織后，經(jīng)機(jī)械以及消化分離成單個(gè)細(xì)胞或單一型細(xì)胞群，使之在體外模擬人體生理環(huán)境，在無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定的營(yíng)養(yǎng)條件下，生存、生長(zhǎng)和繁殖。原代培養(yǎng)細(xì)胞常有不同的細(xì)胞成分，生長(zhǎng)緩慢，但是更能代表所來(lái)源的組織細(xì)胞類型和表達(dá)組織的特異性特征。利用原代細(xì)胞培養(yǎng)做各種實(shí)驗(yàn)，如藥物測(cè)試、細(xì)胞分化及病毒學(xué)方面的試驗(yàn)效果很好。其操作步驟如下。

1、剪切組織：先將所取得的組織，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手術(shù)去除黏附的結(jié)締組織等非培養(yǎng)所需組織。再次清洗后，用刀將組織切成若干小塊，移入青霉素小瓶或小燒杯中，加入適量緩沖液，用彎頭眼科剪，反復(fù)剪切組織，直到組織成糊狀，約1mm3大小。靜置片刻后，用吸管吸去上層液體，加入適當(dāng)?shù)木彌_液再清洗一次。

2、消化分離：消化分離的目的是將細(xì)小的組織塊消化分離成細(xì)胞團(tuán)或分散的單個(gè)細(xì)胞，以利于進(jìn)一步的培養(yǎng)，常用的消化酶有胰蛋白酶和膠原酶。

3、培養(yǎng)：細(xì)胞懸液用計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用培養(yǎng)液將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為（2～5）×105 cells／ml，或?qū)嶒?yàn)所需密度，分裝于培養(yǎng)瓶中，使細(xì)胞懸液的量以覆蓋后略高于培養(yǎng)瓶底部為宜。置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，5％CO2，37℃靜置培養(yǎng)。一般3～5d，原代培養(yǎng)細(xì)胞可以黏附于瓶壁，并伸展開(kāi)始生長(zhǎng)，可補(bǔ)加原培養(yǎng)液量1／2的新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2～3d后換液，一般7～14d可以長(zhǎng)滿瓶壁，進(jìn)行傳代。

4、注意事項(xiàng)：

1）無(wú)菌操作：細(xì)菌或霉菌污染是培養(yǎng)失敗的常見(jiàn)原因，必須加強(qiáng)各個(gè)環(huán)節(jié)的無(wú)菌操作觀念，以預(yù)防為主，一旦污染，一般很難消除。

（2）培養(yǎng)液：所用的培養(yǎng)液必須滿足細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的必要條件。由于細(xì)胞來(lái)源的動(dòng)物種類、組織類型不同，對(duì)培養(yǎng)液的要求有一定的差異，必要時(shí)可用預(yù)實(shí)驗(yàn)的方法選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液。

（3）小牛血清：小牛血清對(duì)于維持培養(yǎng)細(xì)胞的生存和促進(jìn)細(xì)胞增殖起著關(guān)鍵性作用。可選擇多種不同批號(hào)的小牛血清進(jìn)行小樣分析。一旦確定某一廠家的某一批號(hào)小牛血清后，就保持應(yīng)用至實(shí)驗(yàn)完成。

（4）膠原酶溶液：必須新鮮配制，貯存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(即使是-20℃低溫保存)，也將影響消化效力，導(dǎo)致消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞損傷增加。

（5）L-谷氨酰胺：幾乎所有細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺都有較高的要求，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，在缺少谷氨酰胺時(shí)，細(xì)胞會(huì)因生長(zhǎng)不良而死亡。谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱貯存兩周以上時(shí)，就應(yīng)重新加入原來(lái)量的谷氨酰胺。

（6）靜置培養(yǎng)：原代細(xì)胞在消化分離后，置于CO2培養(yǎng)箱的頭24～48h (必要時(shí)72h)內(nèi)，應(yīng)處于絕對(duì)靜置狀態(tài)，切忌不時(shí)地取出培養(yǎng)瓶觀察生長(zhǎng)狀況，這將使原代分離細(xì)胞難以貼壁，更談不上伸展和增殖，初學(xué)者尤應(yīng)注意。不必?fù)?dān)心培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)消耗光，在細(xì)胞增殖之前對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求并不大。原代培養(yǎng)初期僅加一薄層培養(yǎng)液的目的也在于有利于細(xì)胞貼壁伸展。

（7）消化時(shí)間：一般消化至肉眼尚可見(jiàn)微小組織顆粒即可，因?yàn)榇藭r(shí)組織顆粒已經(jīng)松散，略經(jīng)吹打即成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，過(guò)久的消化往往導(dǎo)致細(xì)胞損傷加重，細(xì)胞培養(yǎng)成活率降低。

（8）其他生長(zhǎng)因子：經(jīng)過(guò)以上處理，一般原代分離細(xì)胞培養(yǎng)均可以成功。對(duì)于少數(shù)特殊類型細(xì)胞也可以考慮加一些特殊的生長(zhǎng)因子，如胰島素能促使細(xì)胞攝取葡萄糖和氨基酸。另外，內(nèi)毒素、EGF、FGF等均有促有絲分裂作用，但費(fèi)用較高。

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