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如何鑒定提取出來的外泌體？

以目前外泌體的分離手段很難獲得十分純凈而且單一的外泌體樣品，也沒有任何一個(gè)單一實(shí)驗(yàn)可以確定外泌體的存在。根據(jù)國際細(xì)胞外囊泡協(xié)會(huì)發(fā)表的指導(dǎo)手冊(cè)《MISEV 2018》，外泌體特征鑒定通過NTA測(cè)粒徑分布、TEM電鏡分析形態(tài)、WB檢測(cè)標(biāo)志蛋白三項(xiàng)來驗(yàn)證。NTA分析樣品中外泌體的粒徑分布和顆粒濃度，TEM電子顯微鏡來觀察樣品中外泌體的形態(tài)特征，WB檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白。

外泌體如何保存？

不同時(shí)間、溫度的保存對(duì)不同的外泌體樣本影響不一；如果研究方向?yàn)橥饷隗w形態(tài)特征、蛋白或其他功能性分析，在分離后新鮮使用為最佳。目前主流的建議是提取出外泌體后最好是新鮮使用，或低溫短期保存。

短時(shí)間幾天內(nèi)可以放4°C，長時(shí)間儲(chǔ)存置于-80°C保存。

NTA檢測(cè)可以進(jìn)行外泌體定量嗎？

NTA是物理方法，基于顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)，因?yàn)椴还苁侵|(zhì)體、蛋白，甚至是PBS中的顆粒（部分實(shí)驗(yàn)室自行配置的PBS中發(fā)現(xiàn)大量顆粒，推薦在外泌體研究中，用VC品牌的PBS（P/N:C3580-0500），避免干擾），都會(huì)被軟件讀取，并不能分辨是否為外泌體。但NTA提供的粒徑分布可供判斷所提取的內(nèi)含物是否在外泌體的粒徑范圍內(nèi)；另外，在做外泌體分泌的對(duì)比實(shí)驗(yàn)中，NTA提供的濃度值也可以作為重要的參考數(shù)據(jù)。

外泌體NTA檢測(cè)需要多少量？

Zetaview儀器的最佳檢測(cè)區(qū)間是10^7 particles/ml，且有濃度檢測(cè)下限，為10^5 particles/ml，一般進(jìn)樣量不少于2 ml；

無法準(zhǔn)確建議送樣量，檢測(cè)需要量與樣本本身濃度有關(guān)，樣本濃，則用量小，反之則多，根據(jù)檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)，樣本取用量一般在2 µl-100 µl不等，取用量大于50 µl時(shí)大多由于樣本分泌量過低、提取失敗或者對(duì)樣本有過多稀釋。

一般建議：送樣量不低于30 µl。

外泌體用什么分離方法比較好？

無法明確哪種分離方法比較好，各有千秋，以下列出常用的外泌體分離方法：

超速離心法（差速離心和密度梯度離心）：操作繁瑣，耗時(shí)長，分離外泌體純度較高，但得率低，目前分離外泌體主流方法；

尺寸排阻色譜（Size-exclusion chromatography，SEC）：應(yīng)用填充多孔聚合物微球的柱子，精確分離大小分子，操作簡便，耗時(shí)短，分離外泌體純度較高；

聚合物沉淀法：操作簡便，耗時(shí)短，可能會(huì)同時(shí)分離非囊泡污染物（包括脂蛋白），分離外泌體純度較低；

磁珠免疫法：通過特定的抗體組合從樣本中捕獲不同類型的外泌體，免疫親和技術(shù)具有高特異性、可獲得高純度的外泌體、且不影響外泌體形態(tài)完整等優(yōu)點(diǎn)，是富集表征*的外泌體的優(yōu)選方法。但是此方法效率低，外泌體內(nèi)含物的生物活性易受pH和鹽濃度影響，不利于下游實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

組合方法：如聚合物沉淀法+SEC (CellGS Exo-spin 外泌體純化試劑盒）純化流程溫和，無需高速離心，操作簡便并且產(chǎn)物純度高，分離出的外泌體完好無缺，適用于下游功能研究、WB驗(yàn)證、RNA分析等。