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  類器官是能夠在體外三維培養(yǎng)，并表現(xiàn)出相應(yīng)器官生物學(xué)特征的“最小系統(tǒng)"。隨著類器官培養(yǎng)技術(shù)的不斷進(jìn)步，應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。關(guān)于類器官構(gòu)建原理、培養(yǎng)等方面的問(wèn)題解答，希望能夠?qū)Ω魑恍』锇橛兴鶐椭?/span>

基礎(chǔ)篇

Q1: 類器官培養(yǎng)對(duì)于起始細(xì)胞的來(lái)源有要求嗎？

A1: 目前培養(yǎng)的類器官主要來(lái)源于上皮細(xì)胞，對(duì)于非上皮細(xì)胞來(lái)源的類器官培養(yǎng)方式還需要進(jìn)一步研究。

Q2: 類器官按照起始細(xì)胞的類型，分為幾種呢？

A2: 常見(jiàn)的類器官根據(jù)起始細(xì)胞的類型，可以分為兩種：

（1）腫瘤組織來(lái)源的腫瘤類器官；

（2）干細(xì)胞來(lái)源的類器官，包括：多能性干細(xì)胞 (PSC) /成體干細(xì)胞 (ASC)以及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)。

Q3: 類器官是由單一種類細(xì)胞組成的嗎？

A3: 類器官并不是單一細(xì)胞組成的結(jié)構(gòu)，而是由具有干細(xì)胞性質(zhì)的起始細(xì)胞進(jìn)行分裂和分化，并將多種類型的細(xì)胞自組裝的結(jié)構(gòu)，自組裝后的形態(tài)和功能與體內(nèi)相應(yīng)器官相似。

Q4：在沒(méi)有新鮮組織的情況下，可以用凍存組織提取的原代細(xì)胞進(jìn)行3D培養(yǎng)嗎？

A4：可以的。已有學(xué)者驗(yàn)證過(guò)，將人結(jié)腸癌、甲狀腺癌、肺癌、腎癌和肝癌的手術(shù)組織切碎后，以梯度降溫的方式進(jìn)行冷凍，最終在液氮中保存15-18個(gè)月后進(jìn)行復(fù)蘇和原代細(xì)胞提取，分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行2D和3D培養(yǎng)，證實(shí)了凍存對(duì)于細(xì)胞活力和生長(zhǎng)速度均無(wú)顯著影響^【1】。

當(dāng)然，由于組織來(lái)源不同、凍存條件不同，還需要大家根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行驗(yàn)證，新鮮組織提取的細(xì)胞依然是3D培養(yǎng)的選擇。

Q5：類器官可以像細(xì)胞一樣進(jìn)行凍存和復(fù)蘇嗎？

A5：類器官可以凍存，通常會(huì)在傳代2-3次之后選擇凍存。為了達(dá)到最佳的效果，可以選擇類器官成熟（傳代7-10次）后再進(jìn)行凍存。

Q6：類器官的尺寸需要進(jìn)行控制嗎？

A6：是的，主要的原因是類器官內(nèi)部缺乏循環(huán)系統(tǒng)。

當(dāng)類器官的尺寸較大時(shí)，靠近中心的細(xì)胞難以和外界進(jìn)行氧氣和營(yíng)養(yǎng)成分的交換。因此這個(gè)結(jié)構(gòu)尺寸越大，死亡的細(xì)胞就越多（如圖1）^【2】。我們?cè)谂囵B(yǎng)的過(guò)程中，需要控制類器官的大小在4-5mm以內(nèi)。未來(lái)的類器官技術(shù)可以與血管類器官結(jié)合在一起，建立一個(gè)功能性的封閉循環(huán)系統(tǒng)，用以培養(yǎng)出更大尺寸的類器官。

圖1. TUNEL染色表明較大尺寸的類器官中心有大量細(xì)胞死亡（綠色），比例尺為100μm^【2】

Q7：類器官傳代的標(biāo)準(zhǔn)是什么？

A7：類器官的傳代通常是根據(jù)培養(yǎng)的時(shí)間判斷。一般在7-14天時(shí)進(jìn)行第一次傳代，后續(xù)則每7-10天傳代一次^【3】。

Q8：類器官可以進(jìn)行多少次傳代？

A8：大部分類器官可以在體外連續(xù)傳代10次（>6個(gè)月），甚至有些類器官可以連續(xù)傳代20次（>12個(gè)月）并且維持原有的生長(zhǎng)速度^【4】。

Q9: 鑒定類器官的方法有哪些？

A9: 初步可以通過(guò)顯微鏡和H&E染色觀察形態(tài)；然后可以用Western Blot、qRT-PCR、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)該類器官是否表達(dá)相應(yīng)的biomarker；基因測(cè)序可以鑒定所培養(yǎng)的類器官是否有某些特征丟失；對(duì)于部分類器官，還可以檢測(cè)其是否具有功能，例如：已有研究檢測(cè)出胃類器官可以分泌胃酸，心臟類器官可以自主跳動(dòng)。

Q10: 類器官是如何按照我們的意愿進(jìn)行定向分化的？

A10: 在進(jìn)行類器官培養(yǎng)前，我們需要了解該器官在體內(nèi)的發(fā)育過(guò)程，及早期發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路。

以胃類器官培養(yǎng)為例：胃由前后腸發(fā)育而來(lái)，早期發(fā)育需要由多種信號(hào)通路共同調(diào)控。那么在體外我們需要通過(guò)添加細(xì)胞因子的方式，指導(dǎo)激活/抑制相應(yīng)的信號(hào)通路，來(lái)達(dá)到相同的效果，如：PSCs在Activin A的作用下分化為內(nèi)胚層，Wnt3a、FGF-4和Noggin指導(dǎo)細(xì)胞向向前腸分化^【5】。

問(wèn)：類器官原代培養(yǎng)的挺好的，一傳代就不行了是什么原因？

答：可能是傳代過(guò)程有樣本的丟失，因?yàn)榛|(zhì)膠重選后還是會(huì)有一些類器官在膠里，傳代的時(shí)候可以不用把基質(zhì)膠wan全去除干凈，留一點(diǎn)。

問(wèn)：除了T細(xì)胞，類器官還可以和哪些細(xì)胞共培養(yǎng)？

答：還可以和PBMC、成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)

問(wèn)：類器官?gòu)?fù)蘇的標(biāo)準(zhǔn)是什么？

答：類器官?gòu)?fù)蘇后，培養(yǎng)1周左右，可以正常進(jìn)行傳代說(shuō)明復(fù)蘇效果比較好。

問(wèn)：類器官凍存的標(biāo)準(zhǔn)是什么呢？?jī)龃嫘枰嗌兕惼鞴伲?/span>

答：前5代建議是取2-3孔凍存為1管，1孔大概是20個(gè)類器官左右。

問(wèn)：類器官鑒定的方法有哪些？

答：鑒定方式一是可以從組織層面進(jìn)行，主要是組化鑒定；另外是分子層面，可以進(jìn)行外顯子測(cè)序或者轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等測(cè)序手段。

問(wèn)：類器官培養(yǎng)成功的標(biāo)準(zhǔn)是什么呢？

答：目前還沒(méi)用一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，一般類器官可以穩(wěn)定傳代3代以上，說(shuō)明干性是比較好的。

問(wèn)：類器官長(zhǎng)到多大可以做藥篩呢？

答：一般傳代后長(zhǎng)到200-300um可以進(jìn)行藥篩實(shí)驗(yàn)

問(wèn)：一個(gè)類器官試劑盒 可以養(yǎng)多少個(gè)類器官？

答：2-4個(gè)，100ml的培養(yǎng)基可以養(yǎng)200個(gè)孔。

問(wèn)：類器官可以直接用細(xì)胞系培養(yǎng)嗎?

答：用細(xì)胞系培養(yǎng)的不能成為類器官，只能稱之為細(xì)胞球。

問(wèn)：取材時(shí)為什么剔除脂肪組織？脂肪肝可以做類器官培養(yǎng)嗎？

答：脂肪組織影響后續(xù)消化分離得到的干細(xì)胞純度，脂肪肝也是可以做類器官培養(yǎng)的，消化前可以多清洗幾次，去掉表面脂肪。

問(wèn) ：類器官培養(yǎng)一定需要基質(zhì)膠嗎？

答：基質(zhì)膠主要是為類器官提供支撐作用和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，基質(zhì)膠主要成分有l(wèi)aminin，collagen IV，heparan sulfate proteoglycans。

問(wèn)：如果要做藥篩需要額外去除基質(zhì)膠和培養(yǎng)基嗎？

答：和傳代培養(yǎng)鋪板一樣，藥用培養(yǎng)基稀釋就可以。

問(wèn)：類器官量多小的時(shí)候不需要加消化液？

答：一般是100um以下。

問(wèn)： 想要CTC培養(yǎng)，需要多少樣本量呢？

答：至少50+個(gè)CTC，取樣時(shí)可以多取一些血，CTC細(xì)胞占比比較少。

問(wèn)：原代培養(yǎng)中消化下來(lái)的細(xì)胞是只有干細(xì)胞嗎？

答：消化下來(lái)的細(xì)胞包含各個(gè)種類的細(xì)胞，但是能培養(yǎng)成類器官的只有成體干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞，沒(méi)有干性的細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中不會(huì)增殖分化，養(yǎng)的過(guò)程會(huì)死掉。

問(wèn)：初始量樣本量10*5，活性大于90%，可以培養(yǎng)出多少類器官？

答：培養(yǎng)一代，一般是24孔板的10個(gè)孔。

問(wèn)： 類器官培養(yǎng)一代需要多長(zhǎng)時(shí)間？

答 ：一般需要5-7天，長(zhǎng)得快可3-5天。