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細胞培養(yǎng)中，使用培養(yǎng)板時常見問題解答

1、96，24孔培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿的蓋子都很松，這樣是方便了透氣，但是細菌、霉菌等污染物會不會也隨著溜進去呢?

答：（1）蓋子很松，屬于半開放培養(yǎng)，這樣的目的是透氣(實際上是為了使培養(yǎng)皿外的co2能夠與培養(yǎng)皿充分交換，維持培養(yǎng)基的pH值)。

（2）有利必有弊，這樣增加了污染的可能性。此外這樣還會使培養(yǎng)皿內的液體蒸發(fā)，這對于精確定量的藥物來說就顯得值得注意了。所以以下二條措施是必須的：

a培養(yǎng)箱內空氣必須清潔(定期紫外線照，酒精擦洗，盡量少開關培養(yǎng)箱)

b培養(yǎng)箱內的濕度必須始終保持為100%(培養(yǎng)箱內放置無菌蒸餾水的水槽)。注意無菌操作！

2、我的細胞接種培養(yǎng)板，細胞總是聚集在周邊部分，該如何處理啊?我看有的戰(zhàn)友的細胞卻是聚集在中間，是不是板子的質量問題?

答：請問你的細胞是如何混勻的?是滴管吹打還是振蕩培養(yǎng)板?如果是后者，而且是轉圈搖勻的話，很有可能由于離心力的作用使細胞甩到周邊部分，導致細胞中間少，四周多！自己可以試試！

一個好辦法：在你培養(yǎng)種板之前，把培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱里進行幾個小時的飽和后再取出，種入細胞時力量要輕，可采取用滴頭在培養(yǎng)板孔的側面慢慢加入讓細胞懸液流入板孔中，培養(yǎng)的細胞基本是均勻生長。記住千萬不要用振蕩器振蕩，否則你的細胞就會想你說得那樣聚積在一起。

3、我的細胞傳代很正常，但一種到六孔板里(不管加藥和對照)，總有兩三個孔(隨機)細胞長得不好，很小，像破碎了。有人遇到過這種情況嗎?到底是啥原因呢?

答：可能跟你加液的溫度有關。如果你細胞剛剛拿出來換液加液，培養(yǎng)基也是從4度冰箱拿出來不久，很容易細胞就會凍死了。建議你最好把培養(yǎng)基先在培養(yǎng)箱里邊孵育15min先。

另外，跟你細胞的生長狀態(tài)也有關。加藥之前的細胞可以用高點的血清濃度培養(yǎng)。保證細胞狀態(tài)良好。

或者放在37度水浴鍋里孵育也可以，或者是培養(yǎng)板本身的問題，你再換換其它培養(yǎng)板試試看。再有可能就是細胞狀態(tài)問題了，種板時的血清濃度調高試一下。

4、最近幾天，我用六孔培養(yǎng)板接種細胞，培養(yǎng)24小時后更換培養(yǎng)基，在更換培養(yǎng)基之前，顯微鏡觀察到細胞貼壁，狀態(tài)非常的好，更換了培養(yǎng)基后，立即用顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)每個孔中都近乎有一半的細胞表現(xiàn)出近乎死亡的狀態(tài)。細胞變得非常小，產生大量的碎片，而另一半的細胞一切正常，異常細胞與正常細胞之間存在一條分水嶺，上半個圓是好的，下半個圓就不好，這是怎么一回事?

答：你可以看一下是不是以下這幾個原因

a、培養(yǎng)板沒放水平；

b、你的培養(yǎng)液如何，如果培養(yǎng)液過期，細胞就不會貼壁。換一點新配制的培養(yǎng)液試一試

c、可能是板的問題，換一個牌子的板或換用培養(yǎng)瓶就沒問題了。

d、換培養(yǎng)基的時候有沒有注意風機的影響，特別是所需換液的培養(yǎng)板很多時，容易使細胞因風吹失水而干縮破裂。如果如此，換液時應該逐個培養(yǎng)板進行，別怕浪費吸管，注意操作的效率!

5、把細胞消化接種到24孔板之后，已經四天了，老是每孔的中間部分長不滿，每天換液時都用PBS 清洗，第二天換液時都出現(xiàn)同樣的情況，每孔的邊緣長的很好，中央大量死細胞?

答：如果細胞周圍密而中間稀疏，大約有如下原因：

培養(yǎng)液加得太少。主要是由于液體張力的問題。

培養(yǎng)箱底部的水是否少了；

細胞接種后震蕩太厲害了。由于離心力作用導致細胞分布到周圍。

細胞分布均勻與否有一點很關鍵，即每種細胞是有個體差異的，別人的細胞操作不一定適合于你。所以要靠自己摸索，且找出專屬于自己細胞的一套規(guī)律，有如下經驗：

（1）所有待接種的細胞懸液在種板前一定要用吸管混勻。

（2）按資料記載，24孔板的液體量為1ml，其實1ml的量足矣。

（3）接種時，要慢慢加樣，且記得輕微旋轉槍頭，加樣不能太快，避免細胞在一個加樣處聚集，且注意在不同的部位進行加樣，即邊加邊活動槍頭，人為使細胞趨于均勻分布。這樣做對細胞均勻分布有一定效果。

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