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如何成為細(xì)胞培養(yǎng)高手？

問世間誰人無憂，唯*逍遙自在。

作為一名終日泡在實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)君，

如何在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中*，超脫輪回

做到一個(gè)人人羨慕的細(xì)胞大神呢？

且看向這里，成為細(xì)胞大神的六個(gè)細(xì)節(jié)。

1. 過濾體系

  自從出現(xiàn)瓶裝培養(yǎng)基之后，培養(yǎng)基過濾的需求就減少了。有些時(shí)候，一些特定細(xì)胞培養(yǎng)支持物的添加可能會(huì)引入一些新的污染。另外，一般認(rèn)為，當(dāng)液體長時(shí)間接觸瓶口外的空氣后重新過濾；所以一般不建議 管/瓶 對(duì) 管/瓶 的傾倒。這時(shí)，很多人會(huì)選擇Millipore的濾嘴配合針筒進(jìn)行再過濾。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，完成500 ml培養(yǎng)基過濾后，手疼腰酸！過濾杯的出現(xiàn)完美的解決了這個(gè)問題，所以，大體積盡量使用過濾杯吧，可靠且輕松，快捷。

2. 培養(yǎng)基的選擇

關(guān)于血清質(zhì)量，業(yè)界流行的澳洲來源 > 北美來源 >南美來源的說法。這一點(diǎn)從價(jià)格上也可見一斑。實(shí)際情況是優(yōu)質(zhì)血清的市場(chǎng)現(xiàn)實(shí)是供不應(yīng)求，所以很多時(shí)候大家就將就了之。如果有好的選擇，盡量使用澳洲來源的血清。

對(duì)于培養(yǎng)基而言，情況顯然是供大于求的，而且品牌甚多：Sigma，Gibco，Hyclone以及各種國產(chǎn)培養(yǎng)基等，當(dāng)然一些國外廠商基于競(jìng)爭(zhēng)及成本的考慮也推出了本土化的培養(yǎng)基。一些人認(rèn)為培養(yǎng)基能用就行，反正細(xì)胞就在那里長著，也沒出現(xiàn)大規(guī)模的傷亡就忽視了培養(yǎng)基的重要性。但是，實(shí)驗(yàn)是對(duì)完美的追求，多處將就會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的將就，得不償失！從細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)際表現(xiàn)（活力，增殖周期，狀態(tài)等）看，*培養(yǎng)基 > 進(jìn)口分裝培養(yǎng)基 > 大部分國產(chǎn)培養(yǎng)基。所以，別再將就培養(yǎng)基了！

3. 支原體檢測(cè)

  支原體污染和細(xì)胞培養(yǎng)機(jī)會(huì)形影不離，堪稱細(xì)胞培養(yǎng)的惡夢(mèng)。前些年有報(bào)道說超過60%的實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞存在細(xì)胞污染的現(xiàn)象。從早期表現(xiàn)看，支原體污染會(huì)讓你感覺不到，可能僅僅是細(xì)胞增速有些減緩；于是還是快樂的做的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不是很理想。事實(shí)是，支原體污染會(huì)影響細(xì)胞代謝，改變細(xì)胞功能等。

  藥典檢測(cè)支原體是培養(yǎng)法，時(shí)間以周記，這顯然不符合科研”快”的需求。PCR法應(yīng)運(yùn)而生，Sigma的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit，擴(kuò)增的是支原體基因組上16S核糖體RNA基因。此區(qū)域高度保守，因此可檢測(cè)多達(dá)19種支原體。但是PCR后的電泳也是一件麻煩的事情，qPCR就是解決方案：LookOut Mycoplasma qPCR Detection Kit。

4. 胰酶的使用

胰酶適合大部多數(shù)細(xì)胞的消化：HEK293，CHO，HeLa等，而這類細(xì)胞我們往往將他定義為“糙”。當(dāng)然，細(xì)胞本身肯定是不糙的，同樣相當(dāng)金貴。只不過這些細(xì)胞對(duì)胰酶的耐受性好，一定濃度下的胰酶對(duì)細(xì)胞狀態(tài)影響不大。

有些細(xì)胞就非常金貴了，堪稱“嬌嫩”，比如：干細(xì)胞/">干細(xì)胞等，就不太適合利用胰酶進(jìn)行消化。另外，如果消化組織進(jìn)而分離細(xì)胞時(shí)使用胰酶也是值得小心的。一個(gè)好的解決方案是尋找一些溫和的替代品：Accutase、Accumax或EZ-LIFT。這些消化劑劑的特點(diǎn)是可替代胰酶，消化后無需用血清失活。尤其是EZ-LiFT™干細(xì)胞/">干細(xì)胞傳代試劑，這是一種無酶、化學(xué)成分限定的干細(xì)胞解離試劑，只選擇性傳代未分化的多能干細(xì)胞，避免人工進(jìn)行群落篩選或細(xì)胞刮鏟的步驟，不需要使用ROCK抑制劑即可產(chǎn)生高細(xì)胞活性，還可以拯救高度分化的ips細(xì)胞培養(yǎng)物。

5. 細(xì)胞計(jì)數(shù)

細(xì)胞計(jì)數(shù)是細(xì)胞培養(yǎng)的日常。血球計(jì)數(shù)器、載破片、蓋玻片的組合折磨的每一個(gè)技術(shù)者的眼睛及耐心。所幸的是，一些公司根據(jù)血球計(jì)數(shù)的原理開發(fā)出了自動(dòng)的計(jì)數(shù)儀，插入裝有細(xì)胞的蓋玻片即可。事實(shí)上，基于血球計(jì)數(shù)原理的另外一個(gè)問題是計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。一般認(rèn)為CV可能在20%以上，這就非常糟糕了，打算加入10000個(gè)細(xì)胞，很可能計(jì)入了15000個(gè)細(xì)胞，這是不能接受的。

另外一個(gè)計(jì)數(shù)方法是基于庫爾特原理---類似與流式的方法，將細(xì)胞挨個(gè)數(shù)一遍。看到這個(gè)，可能想得是：這么大的一起，這么麻煩怎么做日常計(jì)數(shù)？Merck的做法是將這個(gè)設(shè)備小型化了：Sceptor，整體和一把1 ml移液槍類似。15秒內(nèi)完成細(xì)胞技術(shù)且CV小于5%。

細(xì)胞計(jì)數(shù)器Sceptor及其數(shù)據(jù)呈現(xiàn)形式

6. 細(xì)胞凍存

細(xì)胞傳代過程中涉及細(xì)胞凍存。這么說其實(shí)是很有歧義的，嚴(yán)格意義上說獲得細(xì)胞系完成檢測(cè)后一件事就是大批量?jī)龃婕?xì)胞，而后開始進(jìn)行該細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)。常規(guī)來說，一株細(xì)胞的使用周期不宜過長，這樣能排除反復(fù)傳代過程中細(xì)胞生物學(xué)特性的改變。所以，很多時(shí)候他人惠贈(zèng)的細(xì)胞系可能會(huì)存在傳代過多的問題，一個(gè)好的方案是從ATCC或ECACC（歐洲細(xì)胞庫）購買細(xì)胞，這些平臺(tái)的細(xì)胞背景干凈，傳代次數(shù)少。

DMSO是常用的細(xì)胞凍存保護(hù)劑，市面上品牌眾多，質(zhì)量參差不齊。如果使用劣質(zhì)DMSO凍存細(xì)胞，可能從實(shí)驗(yàn)的一步開始就已經(jīng)出了細(xì)胞品質(zhì)不好的問題。推薦使用Sigma的DMSO，較多細(xì)胞凍存驗(yàn)證的；或者直接使用其DMSO無血清細(xì)胞凍存培養(yǎng)基，確保細(xì)胞*。